Durch seine Lage an den Straßen von der Mark Brandenburg nach Rostock sowie von Lübeck nach Pommern erfreute sich Güstrow vom Mittelalter bis ins 19. Jahrhundert einer guten wirtschaftlichen Lage. Von 1556 bis 1695 war die Stadt auch Sitz der Herzoglinie Mecklenburg-Güstrow, zudem gab es bereits seit 1226 ein fürstliches Kollegiatsstift. Die Voraussetzungen für den Bau herausragender Kirchen – der Pfarrkirche und des Doms – waren also gegeben.

Die Pfarrkirche wurde 1308 erstmals erwähnt. Für 1340 sind eine erste Orgel – das Geschenk eines wohlhabenden Bürgers –  sowie 20 (Neben-)Altäre überliefert; 1357 stiftete die Bartholomäus- und 1368 die Katharinenbruderschaft einen Altar für jeweils eine Kapelle, darunter der berühmte Bormann-Altar. Nach einem Brand wurde die Kirche 1508 nach fünfjähriger Bauzeit  wieder eingeweiht, es gab u. a. 18 Altäre und drei Glocken.

Obwohl im Zuge der Reformation 1552 alle Nebenaltäre und Andachtsbilder entfernt wurden, zählt die Ausstattung der Güstrower Pfarrkirche noch heute zu den reichsten der binnenländischen Mecklenburger Stadtkirchen. Die prachtvolle Renaissancekanzel aus Sandstein mit zahlreichen Einzelfiguren stammt aus dem Jahr 1583, das Ratsherrengestühl von 1599. Ebenfalls augenfällig ist das Triumphkreuz von 1516 mit Figuren von Christus, Johannes und Maria sowie Adam und Eva. Bis Ende des 19. Jahrhunderts stand es oberhalb des Altars. Dann meinte man, es beeinträchtige den Blick auf die drei großen Buntglasfenster im Chor, die die Gemeinde gespendet hatte. Das Kreuz erhielt deshalb zusammen mit Maria und Johannes einen Platz an der Seite, die Figuren Adam und Eva wurden an das Schweriner Museum gegeben. 1908 kehrten zunächst das Kruzifix und die Figuren von Maria und Johannes an ihren alten Platz zwischen den Säulen am Anfang des Altarraums zurück, 1928 folgten auf die Initiative von Ernst Barlach auch die Figuren von Adam und Eva.

Die Orgel der Güstrower Pfarrkirche zählt zu den bedeutendsten in Mecklenburg. Ein erstes nachmittelalterliches Instrument einer Schweriner Werkstatt wurde 1608 eingebaut. Man ersetzte es 1764/65 durch eine Orgel aus der bekannten Rostocker Werkstatt von Paul Schmidt, die 1846/47 überholt und 1926 repariert und umgebaut wurde. 1917 hatten die Zinnpfeifen des Prospekts zu Kriegszwecken abgegeben werden müssen, sie wurde 1926 durch Zinkpfeifen ersetzt. 1931 erfolgte schließlich der Einbau  eines neuen Instruments der Firma Sauer/Frankfurt O. unter Beibehaltung des historischen Prospekts von 1764. Sie wurde 1983/85 durch den "Mecklenburger Orgelbau Wolfgang Nußbücker" umgebaut, 2010/11 grundlegend saniert und auf den Stand von 1931  wurde zurückgesetzt.

Vom historischen Geläut der Güstrower Pfarrkirche ist nur noch eine im Jahr 1425 gegossene Glocke erhalten. Die anderen wurden 1942 für Kriegszwecke eingeschmolzen und 1951 durch drei  Stahlgussglocken ersetzt.